Biotechnology géntechnológia enzimek - reverz transzkriptáz
Enzimek Genetic Engineering
reverz transzkriptáz
A reverz transzkriptáz használják transzkripcióját a mRNS komplementer DNS-szál. Amikor tanulmányozása retrovírusok, amelynek genomja tartalmazza az egyszálú RNS-molekulák, azt találtuk, hogy a folyamat az intracelluláris retrovírus integráló fokozat halad genomjában formájában kettős szálú DNS-t a kromoszómák a gazdasejt. 1964 g. Temin feltételezték létezését virusspetsifichnogo enzimet, amely alkalmas szintézisére egy RNS komplementer DNS-mátrix. Erőfeszítések az enzim izolálása sikertelenek voltak, és Temin 1970 g. Mizutani a és függetlenül Baltimore nyitott kívánt enzimkészítmény extracelluláris virionok Rous-szarkóma-vírus. Ez az RNS-függő DNS-polimeráz az úgynevezett reverz transzkriptáz, vagy reverz transzkriptáz.
A leginkább részletes tanulmányozása retrovirális reverz transzkriptáz madarak. Egy virion tartalmaz körülbelül 50-molekulák ezen enzim. Reverz transzkriptáz két alegységből áll - egy (65 kDa) és b (95 kDa) jelen ekvimoláris mennyiségben. Reverz transzkriptáz legalább három enzimatikus aktivitása:
1) DNS-polimeráz, templátként mind RNS-t és DNS-t;
2) aktivitását RN-áz H hidrolizál RNS RNS hibrid készítmény - DNS, de nem egyszálú vagy kettős szálú RNS;
3) egy DNS-endonukleáz aktivitást.
Az első két tevékenység szintéziséhez szükséges virális DNS- és endonukleáz, láthatóan, fontos, hogy az integráció a vírus DNS-nek a gazdasejt genomjába. Tisztított reverz transzkriptáz szintetizálja a DNS-RNS-t és DNS-t mátrixok. A szintézis indításához, reverz transzkriptáz, valamint más polimerázok, szükséges egy rövid duplaszálú rész (primer). A primer lehet egyszálú szegmens mind RNS, mind DNS-t, amely a reakció során kovalensen kötődik a DNS-szálhoz újonnan termelt.

Ábra. Reakcióvázlat 35. szintézise kettős szálú DNS-kópiákat RNS-molekulák
A reverz transzkriptáz előnyösen használható a messenger RNS egy komplementer DNS (cDNS). A reverz transzkripciós reakciót egy speciálisan megválasztott körülmények alkalmazásával erős inhibitorai az RNáz-aktivitás. Így lehetséges, hogy teljes hosszúságú DNS-kópiát RNS célmolekulák. Mivel a primer reverz transzkripció poli (A) -tartalmú mRNS oligo (dT), és egy olyan RNS molekulát hiányzik Z'-poli (A) vége, - kémiailag szintetizált oligonukleotidok komplementer Z'-end RNS vizsgálták. Szintézise után mRNS komplementer lánc DNS-t és RNS-t megsemmisítése (általában használt lúgos kezelés) hajtjuk végre a szintézis a második DNS-szál. Így az a képesség, hogy használni reverz transzkriptázzal, hogy létrejöjjön egy 3'-terminálisához egyszálú cDNS volt, önmagával komplementer hajtű, amely elvégzi a funkció egy primer.
A sablon szolgál az első szál cDNS-t. Ezt a reakciót katalizálhatjuk mind reverz transzkriptáz és DNS polimeráz I E. coli. Az eredmények azt mutatják, hogy a kombináció a két enzim növeli a hozamot a teljes értékű kétszálú cDNS-molekulák. Az adagolás befejezése után a szintézis az első és a második szál cDNS marad kovalensen kötött hajtű hurok, amely szolgált primer szintézisében a második szál. Ez a hurok hasítja endonukleáz S1, specifikusan elpusztítja egyszálú nukleinsavak oldalakon. Végein alakítottak nem mindig tompaszög, valamint a hatékonyság növelése a későbbi klónozáshoz repair tompává Klenow-fragmens DNS-polimeráz I E. coli. Az így létrejövő kettős szálú cDNS-t azután beágyaz klónozó vektorokba szaporítjuk hibrid DNS-molekulák, és a további vizsgálatokhoz felhasználjuk.
További fejezetek ez a rész: